Прибор для определения антиоксидантной активности растительных лекарственных экстрактов и напитков

"МИС-РТ" - 2004. Сборник №34-2-1

Прибор для определения антиоксидантной
активности растительных лекарственных
экстрактов и напитков

Яшин А.Я., Яшин Я.И.

ОАО Научно-производственное объединение "Химавтоматика",
г. Москва, тел. (+7-095) 181-5327, тел./факс. (+7-095) 181-6322,
yashinchrom@comail.ru ,
http://www.chimavtomatika.ru

ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие проявляется большой интерес к определению антиоксидантной активности лекарственных форм, биологически активных веществ, пищевых продуктов и напитков. Это связано с тем, что общепринято считать одной из основных причин наиболее опасных заболеваний - накопление свободных радикалов в организме человека. Концентрация свободных радикалов (супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксил радикал и др.) возрастает за счет снижения активности естественной антиоксидантной системы человека, связанной с воздействием радиации, УФ облучения, курения, алкоголизма, постоянных стрессов, инфекционных болезней, некачественного питания. За счет вредных воздействий свободных радикалов повреждаются стенки сосудов, мембраны, окисляются липиды, что приводит к серьезным патологическим изменениям, к сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям, а также к преждевременному старению [1-3]. Вредное воздействие на организм "свободных радикалов" можно уменьшить за счет систематического употребления некоторых лекарственных растительных препаратов, биологически активных добавок, продуктов питания и напитков, обладающих хорошей антиоксидантной активностью. Основные природные антиоксиданты - витамины Е и С, полифенолы, флавоноиды, ароматические оксикислоты, антоцианы и др. Антиоксиданты защищают клеточные структуры от повреждения их свободными радикалами, это предохраняет организм человека от болезней.

В связи с этим оценка антиоксидантной активности разных лекарственных форм - весьма актуальная задача. За прошедшее десятилетие предложено много методов определения антиоксидантной активности, предложены новые реагенты, модельные системы и приборы.

Среди электрохимических методов и устройств следует выделить вольтамперометрический (режим постоянно-токовой вольтамперометрии или катодная вольтамперометрия) с ртутнопленочным рабочим электродом, реализованный в вольтамперометрическом анализаторе ТА-2 ("Техномет", г. Томск) [4]. Под руководством Х.З. Брайниной разработан малогабаритный антиоксидантный тестер с пределом обнаружения 10^-6М антиоксиданта. В США для оценки антиоксидантной активности плазмы крови с диагностическими целями разработан тестер Electro-Ox^тм также на электрохимическом принципе.

В работе [5] предложен метод одновременного определения общего полифенольного индекса и общего антоцианового индекса с использованием инжекционно-проточной установки и спектрофотометрическим детектированием на двух длинах волн 280 и 520 нм.

Аппаратура для жидкостной хроматографии использована для определения антиоксидантов с двумя детекторами: со спектрофотометрическим на диодной матрице и хемилюминесцентным [6]. Определение антиоксидантной активности фенольных соединений (оксикислот, флавоноидов, токоферолов) методом ВЭЖХ с кулонометрическим детектором приведены в работе [7]. Показано, чем меньше потенциал окисления фенольных соединений, тем больше его антиоксидантная активность.

В настоящей работе описан новый электрохимический прибор определения антиоксидантной активности экстрактов лекарственных трав, напитков (чая, кофе, соков, вина, пива и др.), биологически активных добавок к пище и др. объектов.

ПИНЦИП ДЕЙСТВИЯ И ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ПРИБОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

Рис.1. Принципиальная схема электрохимического прибора для определения антиоксидантной активности [8].

Прибор включает в себя: емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового крана, амперометрический детектор, состоящий из термостатируемой электрохимической ячейки со сменными рабочими электродами, усилитель тока, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала. Прибор позволяет проводить прямые количественные измерения антиоксидантной активности исследуемых проб, содержащих биологически активные соединения. Амперометрический детектор может работать в трех режимах: постоянном потенциале, импульсных потенциалах и при сканировании потенциалов во всем диапазоне, причем варьируя полярность и величины приложенных потенциалов можно определять не только суммарную антиоксидантную активность, но и активность отдельных классов биологических соединений.

Прибор работает следующим образом: насос постоянно прокачивает растворитель, забирая его из емкости, через всю систему. В кран-дозатор в положении "отбор проб" вводится стандартным шприцем на 1 мл в дозируемую петлю исследуемый раствор. Поворотом ручки крана в положение "анализ" поток растворителя направляет определенную дозу исследуемого вещества в ячейку детектора. В ячейке детектора на поверхности рабочего электрода происходит окисление молекул исследуемого вещества, при этом возрастает электрический ток между двумя электродами. Величина электрического тока зависит от природы анализируемого вещества, природы рабочего электрода и потенциала, приложенного к электроду.

Возникающие электрические токи очень малы в пределах 10^-6 - 10 ^-9 А, эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем, с помощью АЦП, преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера, в случае необходимости выходные результаты можно распечатать на принтере.

Рабочий электрод выполнен из стеклоуглерода, который наиболее универсален при определении полифенольных соединений. Потенциал может изменяться от 0 до 2 В, потенциалы ионизации фенольных соединений варьируются в пределах 100 - 1000 мВ. (таблица 1).

В работе [7] электрохимическое окисление может быть использовано как модельное при измерении активности поглощения свободных радикалов, в соответствии со следующими уравнениями:

флавоноид-О-Н*флавоноид-О^. + e + Н⁺

(окисление при максимальном потенциале)

флавоноид-О-Н*флавоноид-О^. + Н^.

(улавливание свободным радикалом)

Обе реакции включают разрыв одной и той же связи О-Н^., Н^. состоит из e + Н+. Таким образом, способность к захвату свободных радикалов флавоноидами или другими полифенолами (т.е. их антиоксидантная активность) [7] может измеряться величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде амперометрического детектора.

Сигнал регистрируется в виде дифференциальных выходных кривых. С помощью специального программного обеспечения производится расчет площадей или высот пиков (дифференциальных кривых) анализируемого и стандартного веществ. Для анализа используется среднее значение из 3-5 последовательных измерений. В качестве стандартных веществ можно использовать следующие общеизвестные антиоксиданты: рутин, кверцетин, дигидрокверцетин, мексидол, тролокс, аскорбиновую кислоту, галловую кислоту и др. Амперометрический прибор имеет ряд преимуществ при определении антиоксидантной активности. Без учета пробоподготовки время отдельного определения занимает несколько минут. Анализ (регистрация и обработка результатов) проходит в реальном времени; Правильность и воспроизводимость анализа обеспечивается за счет точного дозирования шестиходовым краном; объем дозируемой петли может меняться от 20 до 500 мкл; СКО дозирования краном менее 0,5%; СКО последовательных измерений анализируемых проб < 3% (рис. 2)

Рис.2. Воспроизводимость последовательных 8 дозирований разбавленных растворов бальзама "Тайга" (СКО < 3%).

Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов (10^-9 -
10^-12г), при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. Меняя величину приложенного потенциала можно дифференцировать антиоксиданты по классам, дифференциация возрастает при применении импульсного режим работы амперометрического детектора, имеющегося в приборе; кроме того, можно определять в автоматическом режиме вольтамперограммы для идентификации антиоксидантов. Амперометрическое детектирование в импульсном режиме выполняется автоматически с помощью серии из нескольких кратковременных потенциалов. Детектирующий потенциал выбирается соответствующим для определения конкретных соединений. Он налагается в течение короткого времени. Типичное значение детектирующего времени 100-400 мс. После детектирования поверхность электрода очищается при высоком положительном потенциале в течение 50-200 мс и затем восстановления при отрицательном потенциале в течение 100-400 мс, прежде чем наступит новый цикл. В импульсном режиме амперометрический детектор работает стабильно длительное время. Отношение сигналов к одному и тому же антиоксиданту при разных потенциалах может быть также использовано для идентификации; Высокая селективность определения только антиоксидантов, т.е. соединений, способных к окислению; другие соединения, присутствующие в сложных смесях, не мешают их определению. Для анализа не требуется никаких химических реактивов (кроме стандартов), поэтому стоимость анализа очень низкая.

Таблица 1. Значение потенциалов, при которых реализуются наибольшие сигналы

Соединения	Число групп ОН	Потенциалы, mВ
Оксикислоты: Галловая Протокатехиновая Кофейная Феруловая n-кумариновая	3 2 2 1 1	100 150 150 400 750
Флаван-3-олы: (+) катехин (-) эпикатехин (-) эпиталлокатехин	3 3 4	100, 600 100, 600 900
Флаваноны: Нарингенин Эриодиктиол	1 2	300, 800 100, 850
Флавонолы: Кверцетин Мирицетин Изо кверцетин Рутин	3 4 2 1	300, 900 100, 700 250, 800 300, 900
Токоферолы: a- токоферол g- токоферол d- токоферол	1 2 3	200 300 400

Примечание: число гидроксильных групп учитывается в положениях: C-3, C-2', C-3', C-4', C-5'

Таким образом, в настоящей работе показана возможность нарушения равновесного орто/пара-отношения в воде в результате ее контакта с адсорбентом и способность метастабильных орто- и пара-модификаций существовать в виде самостоятельных субстанций на протяжение длительного времени. Высказано предположение о возможном нарушении орто/пара-отношения в естественных процессах. Показано, что эффект нарушения спинового равновесия при конденсации паров воды может иметь важное значение для распространения излучения и радиационного баланса в атмосфере.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 02-05-64529

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Свободные радикалы в биологии. Часть 1./ Под редакцией акад. Н.М. Эммануэля М. Мир-1979-с308.
Kehrer J., Free Radicals as Mediators of Tissue Injury and Desease, Critical Reviews in Toxicology, 1993, v23, p21-48.
Acworth I.N., Bailey B. The Handbook of Oxidative Metabolism ESA. Inc. 1995.
Короткова Е.И., Корбаинов Ю.А., Аврамчик О.А. Новый вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов. Тезисы докладов VI Международной конференции "Биоантиоксидант" Москва 16-19 апреля 2002 г., с298-299.
Gonzalez-Rodriguez J., Perez-Juan P., Luque de Castro M.D. Method for the simultaneous determination of total polyphenol and anthocyan indexes in red wines using a flow injection approach Talanta, 2002, v56, p53-59.
Dapkevicius A., Van Beek T.A., Niederlander H.A.G. Evaluation and comprasion of two improved techniques for the on-line detection of antioxidants in liquid chromatography eluates J. Chromatog. 2001, v912, p73-82.
Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset C. Talanta 2000, v.51, p.709-716.
Яшин Я.И., Яшин А.Я., Пахомов В.П. Установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных соединений. Решение о выдаче патента на изобретение №2003123073/15 (024965). Дата подачи заявки 25.07.2003 г.