SRC "IKAR" - 31 years with you
skip

"МИС-РТ" - 2002. Сборник №27-1.

Влияние низко-интенсивного
лазерного излучения на активность
процесса фагоцитоза.

Д.В. Рудик, Е.И. Тихомирова, И.О. Бугаева ( sb27-1.zip)
Кафедра микробиологии Саратовского Государственного Университета.
RudikDV@info.sgu.ru

    В последние годы внимание многих исследователей привлекают физические методы воздействия на биосистему, в частности использование различных видов лазерного излучения. В последнее время получили широкое распространение полупроводниковые лазерные приборы, излучающие в ближнем инфракрасном и красном диапазонах. Эти лазеры в десятки раз экономичнее, значительно меньше по габаритам и весу, их параметры регулируются без дополнительных приспособлений, а длина волны (от 600 до 1400 нм) позволяет доставить энергию к тканям и органам человека на глубину до 5 -6 см [6].

    У излучения полупроводниковых лазеров достаточно широкий спектр действия. Это излучение активизирует многие процессы в организме, повышая энергетический обмен, оказывает противовоспалительное, анальгезирующие действие, стимулирует репаративные процессы [1,2,6].

    Лазерное излучение по данным литературы вызывает изменение кислородного баланса и активацию окислительно-восстановительных процессов, подавление перекисного окисления липидов (ПОЛ) и образование свободных радикалов, потенцирование действия антиоксидантов. При этом происходит повышение активности каталазы, пероксидазы, активация других ферментативных систем клетки, в частности, сукцинат-дегидрогеназы, НАД-Н2, НАДФ-Н2, АТФазы, альдолазы кислой и щелочной фосфатаз. Ряд концепций, объясняющих биологические эффекты НИЛИ, фиксируют внимание на его способности изменять структуру и конформационную подвижность элементов биомембран [6], а также возможности изменения структуры мезоморфной жидкокристаллической матрицы [5].

    Результаты исследований относительно стимуляции системы иммунитета при лазерном воздействии весьма противоречивы, поскольку разные авторы используют различные виды излучения, дозы и режимы воздействия.

    Базой для развертывания специфических - имунных процессов, являются более древние реакции, связанные с воспалением. Поскольку они присутствуют в любом организме до начала агрессии, их называют естественными. Основной группой клеток, обеспечивающих реакции естественного иммунитета, являются фагоцитирующие лейкоциты. По особенностям морфологии и функции их разделяют на мононуклеарные фагоциты и гранулоциты, что примерно соответствует предложенному И.И. Мечниковым разделению на макро- и микрофаги. Особенно многообразна роль главных эффекторных клеток этой группы - макрофагов. Макрофаги в отличие от гранулоцитов мобилизуются позже (через часы, сутки), но обладают более значительным фагоцитарным потенциалом и разнообразным спектром эффекторных функций. Основным проявлением активации макрофагов является повышение их фагоцитарной способности и эффективности (завершенности) фагоцитоза.

    Цель настоящего исследования: изучить влияние красного и инфракрасного лазерного излучения на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов in vitro, оценить эффективность (завершенность) фагоцитоза.

Материалы и методы

    Макрофаги выделяли по общепринятой методике [4]. Полученный от белых мышей перитонеальный экссудат центрифугировали при 5 000 g в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспендировали в 2 - 3 мл среды 199 и переносили в стерильные пробирки с покровными стеклами, на которые адсорбировались макрофаги. Концентрацию полученных клеток подсчитывали в камере Горяева и определяли % жизнеспособности [3].

    Затем к полученным перитонеальным макрофагам (ПМФ) добавляли взвесь суточной культуры Staphylococcus aureus (клинический штамм №9) из расчета 1 макрофаг на 50 бактериальных клеток (1:50).

    После 30 мин инкубации при температуре 37?С стекла с адсорбированными макрофагами подвергали действию НИЛИ в разных режимах.

    Для изучения влияния НИЛИ на процесс фагоцитоза нами была собрана установка на базе микроскопа МБР-13 со встроенными полупроводниковыми лазерными излучателями. Воздействие осуществляли двумя типами излучения: инфракрасными лучами в диапазоне 810 - 890 нм и лучами красной области спектра в диапазоне 665 - 667 нм на макрофаги в стадии адгезии и фаголизосомы в течение 1 и 30 сек. Контролем служили не облученные макрофаги.

    Через 30 мин, 1 час и 6 часов последующей инкубации обработанных НИЛИ клеток при 37?С покровные стекла с адсорбированными фагоцитирующими макрофагами фиксировали в смеси Никифорова. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, с использованием окуляра х10 и иммерсионного объектива х90 определяли число активных макрофагов на разных стадиях фагоцитоза. Расчитывали фагоцитарный индекс (ФИ), а также индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) [3].

Результаты и их обсуждение.

    При воздействии инфракрасного лазерного излучения (ИКИ) в течение 1 секунды количество активных макрофагов на стадии адгезии увеличивалось от 18 ± 0,1% в контроле до 25±0,4% (РР0,05). Через 1 час после ИК лазерного воздействия (на стадии фаголизосомы) количество активных макрофагов возросло по сравнению с контролем (24±0,1%) и соответствовало 42±1,2%(Р Р0,05). Через 6 часов (на стадии киллинга бактерий) процентное содержание активно фагоцитирующих клеток перитонеальной жидкости, облученных ИК лазером животных , возрастало до 56±0,8%.

 

Таблица 1. Оценка фагоцитарной активности макрофагов перитонеальной жидкости (M±m) в %.

Эксперимент Стадии фагоцитоза Примечание
30 сек стадия адгезии 1 час стадия фаголизосомы 6 часов стадия киллинга бактерий
Контроль 18 ± 0,1 24 ± 0,1 32 ± 0,6 Без воздействия НИЛИ
Красное излучение(1 сек) 14 ± 0,1 21 ± 0,5 17 ± 0,5* Угнетение активности ПМФ
Красное излучение(30 сек) 12 ± 0,5 Большинство клеток разрушено Сильное угнетение активности ПМФ
Инфракрасное излучение(1 сек) 25 ± 0,4* 42 ± 1,2* 56 ± 0,8* Усиление стадии адгезии, усиление киллинга бактерий
Инфракрасное излучение(30 сек) 28 ± 0,4* 39 ± 0,7* 82 ± 0,1* Эффект "облепленных бактериями макрофагов", значительное усиление киллинга бактерий

* - наличие достоверности при уровне значимости РР0,05.

 

 

    Использование ИКИ с экспозицией 30 секунд приводило к усилению процессов адгезии перитонеальных макрофагов in vitro. Через 30 минут после облучения мы наблюдали т.н. эффект "облепленных бактериями макрофагов". Количество активных клеток увеличивалось (28 ± 0,4%) по сравнению с контролем(18 ± 0,1%) Р Р0,05. Через 6 часов после лазерного воздействия в значительной степени усиливался киллинг бактерий, регистрировались самые высокие значения индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ) (Рис.1) на фоне резкого увеличения количества активно фагоцитирующих макрофагов (82 ± 1,1% и 32 ± 0,6% в контроле, РР 0,01).

    Значительных изменений в активности процесса фагоцитоза, при воздействии лучами красной области спектра в течение 1 сек, выявлено не было, наблюдалось некоторое снижение активности перитонеальных макрофагов по сравнению с контролем (табл).

    Увеличение экспозиции излучения в красном диапазоне до 30 сек приводило к разрушению большинства клеток и подавлению процесса фагоцитоза in vitro (табл ).

    Детальное микроскопирование фагоцитирующих макрофагов позволило установить, что инфракрасное излучение при экспозиции 30 сек усиливает стадию адгезии. Анализ адгезивных свойств фагоцитирующих клеток определяет способность последних мигрировать в зону проникновения патогенного агента и является достаточно информативным для оценки влияния НИЛИ на активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов. В событиях происходящих в мембране фагоцита при его адгезии, большая роль принадлежит актомиозиновой системе, а также переходам гел - золь в системе клеточных коллоидов [5]. Сокращение актиновых волокон и разжижение коллоида обеспечивает инвагинацию мембран и формирование фагосомы. Известно, что адгезия сопровождается синтезом и секрецией биологически активных веществ - цитокинов [7],что в конечном итоге приводит к интенсификации межклеточных взаимодействий, направленных на обеспечение иммунологической защиты. Активация адгезивных свойств, возможно, связана с усилением экспрессии специфических рецепторов на поверхности перитонеальных макрофагов.

    Эффект усиления бактериального киллинга, можно объяснить т.н. "кислородным взрывом" - образованием продуктов частичного восстановления кислорода (короткоживущего - синглетного), свободных радикалов, перекисей и других продуктов, обладающих высокой антимикробной активностью. Вероятно, в наших экспериментах, усиливался кислородзависимый киллинг бактерий. Воздействие на макрофаги ИК лазерного излучения, по-видимому, сопровождалось усилением метаболических процессов, приводящих к образованию бактерицидных субстанций (продуктов метаболизма кислорода и азота, ферментов). В результате, уничтожение агрессивных агентов реализовывалось в форме внутриклеточного (фагоцитоз), внеклеточного (за счет секреции бактерицидных продуктов), а возможно и контактного цитолиза.

Заключение

    Таким образом, нами показано, что НИЛИ инфракрасного диапазона оказывает непосредственное стимулирующие влияние на процессы фагоцитоза макрофагов in vitro, что выражается в интенсификации адгезии, захвата и переваривания микроорганизмов.

    Излучение в красной области спектра, по результатам наших исследований, не приводит к стимуляции фагоцитарной функции макрофагов перитонеальной жидкости in vitro, а напротив, подавляет ее.

 

    Литература

  1. Б.И.Кузник, И.В.Васильев, Н.Н.Цибиков. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. М.: Медицина,1989.
  2. В.Е.Кузьмина, Ю.А.Варижников. Биологическое действие лазерного излучения. Межвуз.сб. науч. работ: Куйбышев, 1984,С.51 - 60.
  3. Практикум по иммунологии. Учебное пособие. Под ред. И.А.Кондратьевой, В.Д.Самуилова. М.: МГУ,2001,224с.
  4. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы.1990, Москва "Мир"
  5. Минц Р.И., Скопинов С.А. // Действие электоромагнитного излучения на биологические объекты и лазерная медицина. Владивосток,1989, С.6 - 41.
  6. В.В.Тучин. Лазеры и волокнистая оптика в биомедицинских исследованиях. Изд. Саратовского ун - та., 1998.
  7. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М:. "Медицина", 1999.