"МИС-РТ" - 2004. Сборник №34-2-1 |
Прибор для определения антиоксидантной
|
Рис.1. Принципиальная схема электрохимического прибора для определения антиоксидантной активности [8]. |
Прибор включает в себя: емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового крана, амперометрический детектор, состоящий из термостатируемой электрохимической ячейки со сменными рабочими электродами, усилитель тока, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала. Прибор позволяет проводить прямые количественные измерения антиоксидантной активности исследуемых проб, содержащих биологически активные соединения. Амперометрический детектор может работать в трех режимах: постоянном потенциале, импульсных потенциалах и при сканировании потенциалов во всем диапазоне, причем варьируя полярность и величины приложенных потенциалов можно определять не только суммарную антиоксидантную активность, но и активность отдельных классов биологических соединений.
Прибор работает следующим образом: насос постоянно прокачивает растворитель, забирая его из емкости, через всю систему. В кран-дозатор в положении "отбор проб" вводится стандартным шприцем на 1 мл в дозируемую петлю исследуемый раствор. Поворотом ручки крана в положение "анализ" поток растворителя направляет определенную дозу исследуемого вещества в ячейку детектора. В ячейке детектора на поверхности рабочего электрода происходит окисление молекул исследуемого вещества, при этом возрастает электрический ток между двумя электродами. Величина электрического тока зависит от природы анализируемого вещества, природы рабочего электрода и потенциала, приложенного к электроду.
Возникающие электрические токи очень малы в пределах 10 -6 - 10 -9 А, эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем, с помощью АЦП, преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера, в случае необходимости выходные результаты можно распечатать на принтере.
Рабочий электрод выполнен из стеклоуглерода, который наиболее универсален при определении полифенольных соединений. Потенциал может изменяться от 0 до 2 В, потенциалы ионизации фенольных соединений варьируются в пределах 100 - 1000 мВ. (таблица 1).
В работе [7] электрохимическое окисление может быть использовано как модельное при измерении активности поглощения свободных радикалов, в соответствии со следующими уравнениями:
флавоноид-О-Н*флавоноид-О. + e + Н+
(окисление при максимальном потенциале)
флавоноид-О-Н*флавоноид-О. + Н.
(улавливание свободным радикалом)
Обе реакции включают разрыв одной и той же связи О-Н., Н. состоит из e + Н+. Таким образом, способность к захвату свободных радикалов флавоноидами или другими полифенолами (т.е. их антиоксидантная активность) [7] может измеряться величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде амперометрического детектора.
Сигнал регистрируется в виде дифференциальных выходных кривых. С помощью специального программного обеспечения производится расчет площадей или высот пиков (дифференциальных кривых) анализируемого и стандартного веществ. Для анализа используется среднее значение из 3-5 последовательных измерений. В качестве стандартных веществ можно использовать следующие общеизвестные антиоксиданты: рутин, кверцетин, дигидрокверцетин, мексидол, тролокс, аскорбиновую кислоту, галловую кислоту и др. Амперометрический прибор имеет ряд преимуществ при определении антиоксидантной активности. Без учета пробоподготовки время отдельного определения занимает несколько минут. Анализ (регистрация и обработка результатов) проходит в реальном времени; Правильность и воспроизводимость анализа обеспечивается за счет точного дозирования шестиходовым краном; объем дозируемой петли может меняться от 20 до 500 мкл; СКО дозирования краном менее 0,5%; СКО последовательных измерений анализируемых проб < 3% (рис. 2)
Рис.2. Воспроизводимость последовательных 8 дозирований разбавленных растворов бальзама "Тайга" (СКО < 3%). |
10-12г), при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. Меняя величину приложенного потенциала можно дифференцировать антиоксиданты по классам, дифференциация возрастает при применении импульсного режим работы амперометрического детектора, имеющегося в приборе; кроме того, можно определять в автоматическом режиме вольтамперограммы для идентификации антиоксидантов. Амперометрическое детектирование в импульсном режиме выполняется автоматически с помощью серии из нескольких кратковременных потенциалов. Детектирующий потенциал выбирается соответствующим для определения конкретных соединений. Он налагается в течение короткого времени. Типичное значение детектирующего времени 100-400 мс. После детектирования поверхность электрода очищается при высоком положительном потенциале в течение 50-200 мс и затем восстановления при отрицательном потенциале в течение 100-400 мс, прежде чем наступит новый цикл. В импульсном режиме амперометрический детектор работает стабильно длительное время. Отношение сигналов к одному и тому же антиоксиданту при разных потенциалах может быть также использовано для идентификации; Высокая селективность определения только антиоксидантов, т.е. соединений, способных к окислению; другие соединения, присутствующие в сложных смесях, не мешают их определению. Для анализа не требуется никаких химических реактивов (кроме стандартов), поэтому стоимость анализа очень низкая.
Таблица 1. Значение потенциалов, при которых реализуются наибольшие сигналы
Соединения | Число групп ОН | Потенциалы, mВ |
Оксикислоты: Галловая Протокатехиновая Кофейная Феруловая n-кумариновая |
3 2 2 1 1 |
100 150 150 400 750 |
Флаван-3-олы: (+) катехин (-) эпикатехин (-) эпиталлокатехин |
3 3 4 |
100, 600 100, 600 900 |
Флаваноны: Нарингенин Эриодиктиол |
1 2 |
300, 800 100, 850 |
Флавонолы: Кверцетин Мирицетин Изо кверцетин Рутин |
3 4 2 1 |
300, 900 100, 700 250, 800 300, 900 |
Токоферолы: a- токоферол g- токоферол d- токоферол |
1 2 3 |
200 300 400 |
Примечание: число гидроксильных групп учитывается в положениях: C-3, C-2', C-3', C-4', C-5'
Таким образом, в настоящей работе показана возможность нарушения равновесного орто/пара-отношения в воде в результате ее контакта с адсорбентом и способность метастабильных орто- и пара-модификаций существовать в виде самостоятельных субстанций на протяжение длительного времени. Высказано предположение о возможном нарушении орто/пара-отношения в естественных процессах. Показано, что эффект нарушения спинового равновесия при конденсации паров воды может иметь важное значение для распространения излучения и радиационного баланса в атмосфере.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 02-05-64529
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Свободные радикалы в биологии. Часть 1./ Под редакцией акад. Н.М. Эммануэля М. Мир-1979-с308.
- Kehrer J., Free Radicals as Mediators of Tissue Injury and Desease, Critical Reviews in Toxicology, 1993, v23, p21-48.
- Acworth I.N., Bailey B. The Handbook of Oxidative Metabolism ESA. Inc. 1995.
- Короткова Е.И., Корбаинов Ю.А., Аврамчик О.А. Новый вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов. Тезисы докладов VI Международной конференции "Биоантиоксидант" Москва 16-19 апреля 2002 г., с298-299.
- Gonzalez-Rodriguez J., Perez-Juan P., Luque de Castro M.D. Method for the simultaneous determination of total polyphenol and anthocyan indexes in red wines using a flow injection approach Talanta, 2002, v56, p53-59.
- Dapkevicius A., Van Beek T.A., Niederlander H.A.G. Evaluation and comprasion of two improved techniques for the on-line detection of antioxidants in liquid chromatography eluates J. Chromatog. 2001, v912, p73-82.
- Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset C. Talanta 2000, v.51, p.709-716.
- Яшин Я.И., Яшин А.Я., Пахомов В.П. Установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных соединений. Решение о выдаче патента на изобретение №2003123073/15 (024965). Дата подачи заявки 25.07.2003 г.